Z določanjem stanja genov je pri oblikovanju zdravljenja omogočen oseben pristop k vsakemu posamičnemu bolniku. Seveda še vedno ne znamo pozdraviti vseh vrst rakavih bolezni, a vse večji je odstotek tistih, katerih zdravljenje se bo odločalo v laboratorijih za molekularno diagnostiko in tako precej natančno tudi napovedalo njihov izid - ki je, npr. pri raku debelega črevesa, ob različici gena, dovzetnega za obstoječe 'zdravilno' monoklonalno protitelo, dokaj ugoden. Bolniki, ki imajo gen, preko katerega tarčno zdravilo učinkuje, nespremenjen (t.i. divji tip) bodo imeli daljši čas do napredovanja bolezni, in kot kažejo najnovejši izsledki tudi daljše celokupno preživetje. O pomenu biomarkerjev govori tudi podatek, da je Ameriško združenje onkologov med temeljna odkritja in novosti v letu 2008 uvrstilo prav testiranje KRAS mutacij pri bolnikih z rakom debelega črevesa.

Kaj pravzaprav pomeni omenjeni termin o KRAS testiranju, kako se tumorske celice izognejo delovanju imunskega sistema, kako vidi nastajanje raka strokovnjak, katerega življenjsko poslanstvo je raziskovanje te zločeste bolezni na molekularnem nivoju, kaj njegova pravilna določitev pomeni za bolnika, kdaj v tumorju pride do aktiviranja KRAS gena, pa tudi o tem, kateri drugi določevalci bolezni še obstajajo, je podrobno razložil znanstveni svetnik. dr. Srdjan Novakovič, pomočnik strokovnega direktorja za raziskovanje in izobraževanje in vodja oddelka za molekularna diagnostiko OI Ljubljana.

V luči spremljanja molekularnih dogodkov je nastanek raka večstopenjski proces. Ali nam lahko te procese na kratko opišete?

»Za začetek bi rad še enkrat spomnil, da rakaste celice nastanejo iz normalnih celic v organizmu. Da bi iz normalne nastala rakasta celica, je nujno, da se zgodi vrsta radikalnih sprememb na različnih genih v celici. Pri rakasti pretvorbi so potrebne in pomembne predvsem spremembe na genih, ki pospešujejo delitev celic, in na genih, ki so vpleteni v različne mehanizme nadzora podvojevanja dednega materiala. Rak je torej genska bolezen, ki nastane kot posledica sprememb na različnih genih.

Proces rakaste pretvorbe poteka v več stopnjah. V prvi stopnji nastajajo stabilne spremembe na dednem materialu (mutacije), ki se z delitvijo celic prenašajo na hčerinske celice; za drugo stopnjo je značilno pospešeno nabiranje novih sprememb, tj. mutacij, ki dodatno vplivajo na delovanje različnih genov. Nakopičene spremembe – mutacije v tretji, zadnji stopnji dokončno povzročijo proces preoblikovanja normalne celice v rakavo, ki tudi izraža vse pridobljene nove lastnosti, značilne za rakave celice.

V prvih dveh fazah torej celica »kopiči« spremembe na ravni genov (spremenjen genotip), vendar na tej stopnji še ne govorimo o rakavi celici. Kot rakavo pojmujemo celico šele takrat, ko se nakopičene spremembe na ravni genov začno tudi odražati v morfologiji celice, njeni fiziologiji ali v načinu obnašanja celice (spremenjen fenotip). To se po navadi zgodi po delitvi celice, ko v hčerinskih celicah podedovane spremembe narekujejo nastanek spremenjenih proteinov, izpad sinteze določenih proteinov ali izpad izražanja celotnih skupin genov, pomembnih za delovanje celice.

Rakava celica se od normalnih celic razlikuje po številnih lastnostih, med katerimi je najpomembnejša njena izjemna sposobnost prilagajanja. Prav ta lastnost ji omogoča, da se popolnoma »osamosvoji«, kar pomeni, da postane neodvisna od signalov (in nadzora) iz okolja in da popolnoma avtonomno nadzira število delitev ter s tem tudi rast in širjenje rakave bolezni. Visoka stopnja prilagodljivosti je tudi vzrok, da se rakasta celica odlično znajde v različnih okoljih, kar ji omogoča prodiranje v druga tkiva in organe. In mogoče najpomembnejše – izjemna prilagodljivost omogoči rakasti celici, da postane »nevidna« za imunski sistem, ki je zaradi tega ne prepozna kot spremenjene in je ne uniči.

Vse naštete prilagoditve skupaj prispevajo k pomnožitvi rakastih celic in nastanku tumorja.«

Kakšno vlogo ima pri tem imunski sistem?

»Najpomembnejšo. V življenju namreč nastajajo v organizmu številne rakaste celice, vendar se iz večine nikoli ne razvije tumor. Vzrok za to je delovanje imunskega sistema. Veliko večino rakastih celic imunski sistem učinkovito prepozna in jih tudi uniči. Imunski sistem torej predstavlja obrambni mehanizem, ki nas varuje pred nastankom tumorjev. Kadar je ta mehanizem poškodovan ali preobremenjen, se zgodi, da nastale rakaste celice lažje »uidejo« njegovemu nadzoru. Takrat se vzpostavijo pogoji za razvoj tumorja. Rakaste celice zelo dobro izrabijo svoje sposobnosti hitre prilagoditve in ustvarjajo pogoje za povečevanje lastnega števila. Tudi na takšen način, da neposredno vplivajo na delovanje imunskega sistema, dokler ga dokončno ne prilagodijo do te mere, da postanejo povsem neprepoznavne zanj. Takrat je odprta pot za razrast tumorja.

Dovolite mi, da še enkrat poudarim, da je nadzor imunskega sistema nad razvojem tumorjev zelo zapleten in natančen proces. Ves čas poteka neusmiljen boj za prevlado med celicami imunskega sistema in tumorskimi celicami. V veliki večini primerov je imunski sistem tisti, ki »sovražnika« premaga, včasih pa na žalost prevladajo rakaste celice.«

Kako se tumorske celice izognejo delovanju imunskega sistema?

»Tumorske celice se na različne načine izogibajo delovanju imunskega sistema. Gre za prilagoditve, ki se zgodijo na tumorskih celicah, s katerimi le-te zmanjšajo svojo prepoznavnost, ali pa za prilagoditve, s katerimi neposredno zavrejo delovanje imunskega sistema (t. i. imunosupresivno delovanje). Tudi imunosupresivno delovanje poteka na različne načine – od tvorbe dejavnikov, ki zavrejo delovanje imunskega sistema, do tvorbe struktur, ki z vezavo na imunske celice povzročijo njihovo smrt.«

Kaj so tumorski označevalci? V čem je njihova uporabna vrednost za bolnika oz. onkologa?

»Ker rakave celice nastajajo iz normalnih celic, je njihovo razlikovanje precej težavno. Zato si ves čas prizadevamo, da bi opredelili čim več sprememb, značilnih za tumorske celice.

V grobem je definicija tumorskih označevalcev, da so to novonastale snovi (neznačilne za celice v zdravem organizmu) ali snovi, ki so v normalnem organizmu prisotne v veliko nižjih koncentracijah. Kot tumorski označevalci se lahko pojavljajo: membranske strukture, hormoni, encimi, produkti različnih genov, podatki o količini dednega materiala v celici in tako naprej.

Uporabna vrednost tumorskih označevalcev je precejšnja na področju diagnostike in tudi za samozdravljenje. V diagnostiki jih uporabljamo za dokazovanje prisotnosti rakavih celic, napovedovanje poteka bolezni, napovedovanje odgovora na zdravljenje, načrtovanje zdravljenja, za odkrivanje ponovnega pojava bolezni. Dokazujemo jih v serumu, v tumorskem tkivu ali celicah ter na dednem materialu (DNK).

V zadnjem času so tumorski označevalci vse pomembnejši tudi za zdravljenje, kjer predvsem služijo kot tarče, tj. za čim bolj učinkovito usmerjanje protitumorskih zdravil v rakaste celice, ali pa sami predstavljajo tarče za določena zdravila.«

Katere tumorske označevalce se uporablja pri bolnikih z rakom debelega črevesa in danke?

»Če govorimo o tumorskih označevalcih, ki jih določamo v serumu bolnikov z rakom debelega črevesa in danke, sta to predvsem karcinoembrionalni antigen (CEA) in karcinomski antigen 19-9 (Ca 19-9). Oba označevalca določamo, da v kombinaciji z drugimi metodami potrdimo prisotnost rakave bolezni ali za sledenje napredovanja bolezni oziroma mogočega odgovora na zdravljenje.

Pomembno je tudi, da ravno pri tej vrsti raka zadnji dve leti na ravni genov z metodami molekularne diagnostike določamo še dva nova označevalca – to sta KRAS in BRAF. Pravzaprav gre za določanje statusa mutacij omenjenih genov – torej ali sta nespremenjena (t. i. divji tip) ali mutirana. Od tega je v veliki meri odvisno, kakšen bo načrt za zdravljenje in kako bo zdravljenje uspešno.«

Vemo, da so nekateri biomarkerji pomembni tudi za odločitev o zdravljenju.

»Prav to sem želel pojasniti – gre namreč za pomembno informacijo, da ob določenih mutacijah na nekaterih genih nekatera biološka zdravila ne bodo učinkovita. In nasprtono – druga biološka zdravila bodo učinkovita samo takrat, ko bo značilna mutacija prisotna. Gre namreč za različno pripravljena biološka zdravila, pri katerih pričakujemo, da bodo delovala samo na tumorske celice, ki nosijo določene značilnosti. Zato so spektri njihovega delovanja včasih izjemno ozko omejeni.«

Ameriško združenje onkologov je med temeljna odkritja in novosti v letu 2008 uvrstilo testiranje KRAS-mutacij pri bolnikih s kolorektalnim rakom. Kako poteka testiranje pri nas?

»Na odkritje pomena določanja mutacij v genu KRAS smo se odzvali takoj. Že dve leti namreč na Oddelku za molekularno diagnostiko rutinsko določamo mutacije v omenjenem genu. Do zdaj smo testirali okoli 600 bolnikov z rakom debelega črevesa in danke.

Najprej naj na kratko pojasnim vlogo proteina, ki nastane kot produkt prevajanja gena KRAS. KRAS-protein je odgovoren za prenos signalov od nekaterih celičnih receptorjev na celični membrani (npr. receptorjev za epidermalni rastni faktor) do celičnega jedra. Gre torej za citoplazemski (znotrajcelični) protein, ki deluje kot prenašalec informacije od membranskih receptorjev do jedra, kjer ta informacija narekuje podvojevanje celice. Za prenos informacije protein preprosto spremeni svojo strukturo – brez zunanjih signalov je v »neaktivni« obliki, če je prisoten signal, ki je posredovan prek receptorjev, pa se njegova oblika spremeni v »aktivno«. Ko posreduje informacijo, se KRAS-protein ponovno vrne v neaktivno obliko in čaka na naslednji signal. Deluje torej kot nekakšno stikalo, ki spusti tok ali ga prekine.

Na zgoraj opisani način deluje normalen – nespremenjen protein, ki je produkt nemutiranega gena KRAS. Če se v genu pojavijo določene značilne mutacije, le-te zaradi spremenjenega genskega zapisa narekujejo nastanek proteina, ki je ves čas v »aktivni« obliki. To pomeni, da ne potrebuje stimulacije receptorjev in zato nenadzorovano spodbuja celico k stalni delitvi.

Ker so prav receptorji za epidermalni rastni faktor dokazano pomembni za razrast različnih vrst tumorjev (med njimi je tudi rak debelega črevesa), so razvili biološka zdravila, ki preprečujejo aktivno delovanje teh receptorjev, kar ima za posledico zmanjšanje tumorske rasti. Vendar ta zdravila delujejo samo, če je KRAS nespremenjen – torej če deluje normalno. Če je mutiran, ta zdravila niso učinkovita, ker je signalizacija prisotna brez vpletanja receptorjev (opisano zgoraj).

Pri testu torej iščemo in določamo mutacije v genu KRAS in na osnovi njihove prisotnosti ugotavljamo, ali je smiselno bolnika zdraviti z biološkim zdravilom ali ne. To je zelo pomembno z dveh vidikov: pravilne odločitve glede nadaljnjega zdravljenja in nepotrebnega dajanja zdravila bolnikom, katerim ne bi pomagalo. Ti bolniki bi od takega zdravljenja imeli le neželene stranske učinke.

Testiranje vključuje standardne postopke v molekularni diagnostiki. Ti večinoma temeljijo na pomnoževanju določenih segmentov genov s pomočjo polimerazne verižne reakcije. V našem primeru za določanje mutacij v KRASU uporabljamo polimerazno verižno reakcijo v realnem času. Postopek je sicer tehnično zahteven, vendar za izkušenega analitika s področja molekularne biologije ne predstavlja večjega problema. Sama izvedba testa v molekularno-diagnostičnem laboratoriju traja največ dva dni.

Za izolacijo DNK največkrat potrebujemo bolnikov vzorec tkiva primarnega tumorja, vklopljen v parafin. Lahko uporabimo tudi zmrznjen vzorec tkiva primarnega tumorja, vzorec metastatskega tkiva (95 % ujemanje z vzorcem tkiva primarnega tumorja) vklopljen v parafin ali vzorec endoskopske biopsije (pri bolnikih, pri katerih ni bila opravljena resekcija tumorja ali metastaze).

Sam postopek testiranja je naslednji: lečeči internist onkolog naroči testiranje za KRAS-mutacijo pri bolniku, patolog izbere ustrezen vzorec tkiva (v vzorcu mora biti najmanj 70 % tumorskega tkiva), ga nareže ter pošlje v molekularnodiagnostični laboratorij. V tem laboratoriju izoliramo DNK iz vzorca prejetega tkiva, izvedemo polimerazno verižno reakcijo v realnem času, odčitamo in podamo končni izvid.«

Kakšne so izkušnje, kakšna so razmerja med mutiranimi in nemutiranimi geni?

»Delež bolnikov z rakom debelega črevesa in danke, ki imajo mutiran gen KRAS, se po podatkih iz literature giblje 30–40 %. Po naših rezultatih je ta delež pri slovenskih bolnikih nekoliko večji – nekje okoli 45 %.«

Ali testirate vse bolnike? Kdaj pridobite podatek o statusu gena KRAS?

»Za testiranje se odloči internist onkolog, ki je odgovoren za sistemsko zdravljenje bolnika. V tem trenutku na testiranje naročajo bolnike pred začetkom zdravljenja z biološkimi zdravili, usmerjenimi proti receptorju za epidermalni rastni faktor. Podatke o statusu gena KRAS torej pridobimo neposredno pred uvedbo zdravljenja z biološkimi zdravili.«

Ali je sprememba na genu KRAS zgodnja oz. kdaj med boleznijo se običajno pojavijo mutacije na genu KRAS? Kaj bi bilo po vašem mnenju najoptimalneje izvesti testiranje?

»Spremembe oziroma mutacije, ki so odgovorne za neodzivnost receptorja na zdravila, se zgodijo zgodaj v procesu rakaste pretvorbe. Zato je smiselno, da se testiranje pri vseh bolnikih opravi takoj po kirurški odstranitvi tumorja. S tem zagotovimo popolnejšo informacijo za načrtovanje zdravljenja in pravočasno uvedbo bioloških zdravil v zdravljenje.

Naj omenim še, da je drugi gen v isti verigi znotrajceličnega prenosa signalov, za katerega je smiselno določati njegov status, gen BRAF. Za zdravljenje z biološkimi zdravili, usmerjenimi proti receptorju za epidermalni rastni dejavnik, je prav tako pomembno, da je BRAF nemutiran. In ker gre po navadi za izključujoče se dogodke – torej če je KRAS mutiran, je BRAF nemutiran in nasprotno, je zelo koristno, da določimo status BRAF pri osebah, pri katerih nismo dokazali mutacij v KRASU.

Želim tudi opozoriti, da določanje statusa genov KRAS in BRAF ter načrtovanje zdravljenja z biološkimi zdravili, usmerjenimi proti receptorju za epidermalni rastni faktor, predstavljata obliko individualnega pristopa k zdravljenju. S tem zagotovimo, da zdravila dobijo samo tisti bolniki, pri katerih pričakujemo, da bodo učinkovita.«


Moje zdravje št. 130 / 7. december 2010