MacFarlane je študiral film, video in animacijo. Po študiju so ga mobilizirali agenti slovitega produkcijskega podjetja Hanna-Barbera, ki so ga zaposlili pri svetovno znanem televizijskem kanalu Cartoon Network. Kot ustvarjalec animirane humoristične serije za odrasle Družinski človek je v ZDA konec 90. let dosegel kultni status.
Njegov igrani celovečerni režijski prvenec Ted je iz leta 2012. Zgodba govori o Johnu Bennettu, odraslemu moškemu, katerega preprosta otroška želja je oživila njegovega medvedka. Skoraj 30 let kasneje je pravljice že davno konec, toda Ted noče zapustiti Johna, kar vse bolj jezi Johnovo dekle Lori Collins, so vsebino filma povzeli na spletni strani Koloseja. MacFarlane je napisal tudi scenarij ter plišasti živali posodil svoj glas.
Leta 2013 je vodil 85. podelitev oskarjev, ki jih podeljuje Ameriška akademija filmskih umetnosti in znanosti. Pri znanstvenofantastični televizijski seriji Orville sodeluje kot režiser in scenarist, poleg tega je prevzel eno od glavnih vlog.
